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実験医学別冊 ラボ必携 フローサイトメトリーQ&A

戸村 道夫 (編)

株式会社 羊土社

313 頁  (2017年11月)

Android 対応製品 iOS/iPhoneOS対応製品

eBook Price(ダウンロード販売): ¥6,912 (税込) 

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リリース日: 2018年07月13日

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フローサイトメトリー解析の実践・現場で役立つことを目的に基礎から応用までをQ & A 形式でまとめたはじめての書籍!

人気雑誌『実験医学』別冊!免疫・がん・再生医療の分野でますますニーズが高まるフローサイトメトリー。「機器の設定」,「抗体や蛍光色素の組合せ」など100種類のQ&Aを揃えました。これからはじめる方もさらに理解を深めたい方にも役立ちます。

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免疫・がん・再生医療の分野でますますニーズが高まるフローサイトメトリー.「機器の設定」,「抗体や蛍光色素の組合せ」など100種類のQ&Aを揃えました.これからはじめる方もさらに理解を深めたい方にも役立ちます.


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フローサイトメトリー解析の実践・現場で役立つことを目的に基礎から応用までをQ&A形式でまとめたはじめての書籍である.少ない蛍光色素数で解析をはじめたい方々から,すでにマルチカラー解析に熟練した研究者まで,自分たちの技術の洗練に役立てて欲しい.そして,フローサイトメトリーという方法は知っているが,今まで接する機会がなかった研究者の皆さんにも,本書を一度手にとっていただきたいと考えながらQを設定した.

フローサイトメトリー解析は,工学技術の発展と解析技術が,お互いのフィードバックすることで,生命科学解析を深化させてきた典型である.多色化,高速化,簡便化の進展はめざましく,ユーザーの裾野が広がっている.しかし,国内では,フローサイトメトリー解析のほぼすべての工程を研究者自身が行うことが多いため,安定したデータ取得には一定以上の知識と経験が要求される.実際,Qの設定を開始してみると,本当に広範な分野にわたる知識と経験の蓄積が,フローサイトメトリー解析には要求されることを改めて認識させられた.

本書では,概論に続きQ1~Q100までを8章に分け,フローサイトメトリー解析の基礎と原理,機器のメンテナンスと設定,抗体・色素の選び方,細胞の調製と染色,データ取得,ソーティング,解析,さらに,哺乳動物以外の非モデル生物での使用で締めてみた.

各Q&Aは完結しているが,関連するQにすぐに飛んで,より深く理解できるように,また,直接的なQが見つからなくてもキーワード索引から必要なQ&Aにたどり着けるようにできるだけ工夫した.各Qは,細かく,あるいは漠然としすぎないように心掛けながら,今まで研究室のなかで代々受け継がれ常識となっている内容も科学的な根拠を知りたいと思い設定した.企画段階からBioLegend社の藤本華恵様,BD Biosciences社の田中聡様,ベックマン・コールター社の井野礼子様にお手伝いいただいた.さらに執筆者の方々とお話しすることで,よりよい構成にまとめることができた.執筆とともにQの設定にも感謝する.

幅広い分野を網羅した本書に対し,既刊の⽛新版フローサイトメトリーもっと幅広く使いこなせる!⽜(羊土社)は,フローサイトメトリー解析において大切な項目について,私も含め各執筆者が詳細に説明している.本書とともに両輪として活用していただきたい.

フローサイトメトリー解析が当たり前のように行われている研究室の日常は,たくさんの検討の末に得られた熟練研究者の経験と研究室に蓄積された職人技に支えられている.しかし,大切な技も情報も,接する機会に恵まれないとなかなか得られず,研究者がラボを離れるとそのまま失われてしまう.そこで,本書では,第一線で活躍し将来を担う若手研究者と,解析機器・試薬で研究を支える企業の方々を中心に執筆していただき,長年にわたる実践的な経験を惜しみなく披露していただいた.本書によって,職人技の将来への伝承とともに,フローサイトメトリー解析を取り入れた研究の発展と裾野が広がることを期待する.

お忙しいなか,お時間を費やして貴重な知識と経験を披露していただいた執筆者の皆様,そして,本書をまとめるとても貴重な機会を与えていただき,出版に至るまで長い間お世話になった羊土社の皆様に改めて感謝する.


2017年9月

秋空の先に葛城山を臨むラボにて
戸村 道夫


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概論 これからフローサイトメトリーをはじめる方のための,基本と解析の全体像

第1章 フローサイトメトリー解析をする前に知っておきたいこと

Q1 フローサイトメトリー解析とは,何を見るための実験手法でしょうか?何ができるのでしょうか?

Q2 フローサイトメトリーではどのような原理で細胞を解析するのでしょうか?

Q3 フローサイトメトリー解析の実際の流れを教えてください.特別な実験手技や,コンピューターの知識は必要でしょうか?

Q4 細胞をソーティングするにはどうすればよいですか?セルソーターのセッティングから具体的な流れを教えてください.

Q5 「蛍光発光の原理」と「励起波長」,「蛍光波長」について,知っておくべきことを教えてください.

Q6 「レーザー光源」と「光学フィルター」について教えてください.「530/30」と記載されたフィルターは,どのような波長を検出するのでしょうか?レーザーの「同軸」「異軸」の違いは何でしょうか?

Q7 コンペンセーション(蛍光補正)とは何でしょうか?

Q8 フローサイトメトリー解析で得られるデータと蛍光顕微鏡・共焦点顕微鏡で得られるデータの違いは何でしょうか?

Q9 フローサイトメトリー初心者が失敗しがちなポイントを教えてください.

第2章 フローサイトメーターの購入・取り扱い,その他装置の基本に関するQ&A

Q10 フローサイトメーターの購入を検討しています."アナライザー"か"セルソーター"か,"エントリーモデル"か"ハイエンドモデル"か,どのように考えればよいでしょうか?

Q11 フローサイトメーターへの細胞の取り込み方法にはどのようなものがありますか?オートサンプラーとは何ですか?気をつけるべき点と合わせて教えてください.

Q12 新しく発売されたフローサイトメーター(アナライザー)を購入するときに注意することは何ですか?レーザーは何本,何色検出できる必要がありますか?購入後にアップグレードすることはできますか?

Q13 各社からいろいろなセルソーターが発売されていますが,どのような違い・特徴がありますか?

Q14 快適にフローサイトメーターを使い続けるために必要なことは何ですか?メンテナンス機器保守契約には入った方がよいですか?

Q15 フローサイトメーター・セルソーターはどのような部屋に設置すればよいのでしょうか?

Q16 フローサイトメーター・セルソーターの起動時,シャットダウン時に気をつけることはありますか?

Q17 一般的な光電子増倍管(PMT)による検出以外にはどのような方法がありますか?

第3章 抗体,色素の特性・選び方に関するQ&A

Q18 まず,4カラーを使いこなすには,どうすればよいでしょうか?分離のよい明るい蛍光色素の選択や,複数の蛍光色素を組合わせる際の注意点を教えてください.

Q19 細胞の蛍光標識方法には,どのような種類があるのでしょうか?

Q20 ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体のどちらを使うべきでしょうか?それぞれの長短所や注意点があれば教えてください.

Q21 カタログにある抗体の「CD分類」と,各種免疫細胞の識別に用いる抗体の組合わせを教えてください.

Q22 フローサイトメトリーに用いる蛍光色素と,蛍光顕微鏡観察に用いる蛍光色素に使い分けはありますか?

Q23 ダイレクト色素(単一)とタンデム色素は何が違うのでしょうか?長短所や注意点を教えてください.

Q24 市販抗体を購入する際に,気をつけるべきポイントを教えてください.

Q25 抗体の保存方法や使用期限について教えてください.

Q26 抗体の至適濃度(希釈倍率)の決め方,染色の条件(細胞数,懸濁液量,温度)を教えてください.

Q27 抗体反応のネガコンとして「アイソタイプコントロール」を用いると聞きましたが,それはなぜですか?また,どのように選べばよいですか?

Q28 できるだけ強くシグナルを検出するには,どのような方法がありますか?

Q29 非標識抗体しか入手できません.目的分子を検出するにはどのような方法がありますか?

Q30 生きたまま細胞核,細胞質,細胞膜などを染色するのに適した色素にはどのようなものがありますか?細胞周期の解析もできますか?

Q31 死細胞を検出・除去するにはどうすればよいですか?アポトーシスとネクローシスは分離できますか?

Q32 細胞固定をしても死細胞と生細胞を区別できる色素があると聞きました.原理と使い方を教えてください.

Q33 市販されている蛍光色素標識抗体の全体像と特徴を教えてください.

Q34 マルチカラー解析で蛍光色素を追加していくときの順番を教えてください.

Q35 マルチカラー解析のパネルを組む際のコツを教えてください.

第4章 サンプル調製(細胞調製と色素標識・抗体染色)に関するQ&A

Q36 血液,培養細胞,組織からの細胞調製では,それぞれ何に気をつけるべきですか?

Q37 腫瘍からの細胞調製と代表的な染色パネルについて注意すべきことを教えてください.

Q38 皮膚からの細胞分離方法と代表的な染色パネルを教えてください.

Q39 腸管からの細胞分離と,代表的な染色パネルを教えてください.

Q40 肺,肝臓からのリンパ球分離方法を教えてください.

Q41 リンパ球組成はマウスの系統間で異なりますか?また,マウスとヒトのリンパ球解析で異なることと気をつけることを教えてください.

Q42 ヒトの末梢血の解析をはじめて行います.解析の概略と代表的な染色パネルを教えてください.

Q43 骨髄血を用いた白血病の診断と治療効果の解析に用いる,代表的な染色パネルを教えてください.

Q44 サンプルが得られたときに染色する時間,あるいは,染色後にフローサイトメーターに流す時間がありません.後日,実験する手段はありますか?

Q45 細胞の抗体染色に適したバッファー(FACSバッファー)の組成を教えてください.

Q46 抗体の非特異的反応性を抑えるには,どうすればよいでしょうか?

Q47 T細胞受容体をMHC+ペプチド-マルチマーで検出したいと考えています.特徴や染色の工夫を教えてください.

Q48 サイトカイン産生細胞におけるサイトカイン検出の原理を教えてください.また,生きたままサイトカイン産生細胞を分離することはできますか?

Q49 細胞表面分子とともに,細胞内サイトカインや細胞核のタンパク質を染色したいです.染色の順番や注意する点を教えてください.

Q50 細胞内シグナリング(リン酸化タンパク質)の検出はどうすればできますか?

Q51 CFSEなどの細胞標識蛍光色素を用いて細胞増殖活性を測定したいと考えています.染色法および解析のコツを教えてください.

Q52 細胞増殖している細胞としていない細胞は,区別することはできますか?

Q53 フローサイトメトリーでは,どのようにコントロール(ネガティブならびにポジティブ)をとればよいでしょうか?

Q54 細胞の絶対数を測定できますか?内部スタンダードのビーズが必要になるのはどのようなときですか?

第5章 測定・リアルタイム解析に関するQ&A

Q55 4カラーのフローサイトメーターを用いてはじめて測定します.何に気をつけるべきですか?

Q56 ネガティブシグナルの検出器電圧設定で注意する点はどこですか?一番感度がよいところに設定するにはどうしたらよいですか?

Q57 測定時には,最低限どのようなゲーティングがあるとよいでしょうか?

Q58 細胞は何個/秒の速度まで流せますか?最適な細胞濃度はどのくらいですか?

Q59 磁気細胞分離法やpre-depletionとは何ですか?どのようなときに必要ですか?

Q60 解析したい細胞の頻度がとても低く,ゲーティングした一部の細胞のデータだけを取得したいです.どうすればよいでしょうか?

Q61 少ない細胞のサンプルからできるだけ多くのデータをとりたいのですが,よい方法はありますか?

Q62 蛍光標識抗体で染色したはずが,シグナルが検出されない場合や,条件設定のときに比べて弱いシグナルしか検出できない場合,どのような原因が考えられますか?

Q63 サンプルの流れが悪く,イベントレートが安定しないときがあります.流れを安定させる方法はありますか?

Q64 途中で凝集塊やエアを吸ってしまいました.次のサンプルの測定前にするべきことは何でしょうか?データは使用できますか?

第6章 セルソーティングに関するQ&A

Q65 細胞をはじめてソーティングするときに,気をつけるべきポイントはありますか?

Q66 ドロップディレイ(Drop Delay)とは何ですか?どのように設定すればよいでしょうか?

Q67 各メーカーでいろいろなソーティングモードがあります.どれを選べばよいでしょうか?

Q68 リンパ球に比べてサイズがとても大きな細胞をソーティングする予定です.ノズル径,シース圧はどのような設定が適していますか?

Q69 ソーティング中,頻繁に詰まってしまい,ストリーム,ドロップがなかなか安定しません.解決方法はありますか?

Q70 ソーティングした細胞を回収するときによい方法やコツはありますか?

Q71 ソーティングしたい細胞の割合が非常に低く,ソートに長時間かかってしまいます.よい解決法はありませんか?

Q72 直接プレートにソーティングする「シングルセルソーティング」はどのようなことができますか?また気をつける点はありますか?

Q73 ソーティング中にエアーを吸ってドロップレット形状が崩れ,ストリームが乱れてしまいました.どうすればよいですか?

Q74 ソーティングによる細胞へのダメージをなるべく少なくしたいです.どのような設定,工夫をすればよいでしょうか?

第7章 データ解析・管理,論文執筆に関するQ&A

Q75 FlowJoの基本機能とあまり知られていない便利な使い方を教えてください.

Q76 細胞のゲーティングの基礎を教えてください.

Q77 データの各パラメーターに表示されている「-A」「-H」「-W」は,どのような意味ですか?データ解析ではどのように扱えばよいですか?

Q78 ゲーティングの過程で死細胞や凝集細胞をゲートアウトできる原理がわかりません.なぜそのようなことができるのでしょうか?

Q79 自家蛍光の高い細胞が目的の細胞に重なってしまい困っています.自家蛍光の高い細胞をゲートアウトすることはできますか?

Q80 腫瘍細胞や組織細胞からリンパ球をゲーティングするコツを教えてください.

Q81 コンペンセーション(蛍光補正)をどの程度かけるべきかがわかりません.また,注意すべきことは何ですか?

Q82 解析したい細胞の頻度が0.1%以下ととても低く苦労しています.よいデータ解析法,表示法はありますか?

Q83 2つのポピュレーションがはっきりと区別できず困っています.どのようにゲーティングすればよいでしょうか?

Q84 蛍光色素数が多いデータを解析していますが,検出しているシグナルが目的のシグナルか,他の蛍光色素からの漏れ込みによるものか判別できません.どうすればよいでしょうか?

Q85 MFI(平均蛍光強度)はどのようなときに使いますか?

Q86 二次元プロットには複数の表示形式がありますが,論文への掲載にはどれが適切ですか?また,Biexponentialとは何ですか?

Q87 フローサイトメトリーの細胞ゲーティングや,統計計算したデータは,どのように表記して,論文投稿すればよいですか?

Q88 実験ノートにはどのような情報を記載したらよいですか?またデータの管理はどうすればよいですか?

第8章 非リンパ球・非モデル生物細胞への適用に関するQ&A

Q89 リンパ組織のストローマ細胞はどのように調製すればよいでしょうか?

Q90 神経細胞の解析と,臨床用のソーティングについて教えてください.

Q91 肝臓幹細胞・前駆細胞のフローサイトメトリー解析と,ソーティングについて教えてください.

Q92 遺伝子導入したiPS細胞を分離したいと考えています.どういう点に注意すればよいでしょうか?

Q93 ウイルスに感染したサルのリンパ球の解析を行いたいのですが,その際の工夫と注意点を教えてください.

Q94 マウス,ヒト,サル以外の哺乳動物や鳥類のリンパ球の解析をしたいのですが,どのような解析が可能でしょうか?

Q95 魚類(サケ・マス類,マグロ類,ゼブラフィッシュやメダカなど)から調製した細胞のフローサイトメトリー解析やソーティングは可能でしょうか?

Q96 非リンパ球,魚類胚由来の細胞など,とてもダメージに弱いデリケートな細胞をダメージレスセルソーターでソーティングしたいと考えています.メリット・デメリット,ソーティングの実際を教えてください.

Q97 病原体を含む細菌をフローサイトメトリーによって解析・ソーティングすることは可能でしょうか?また,注意点は何ですか?

Q98 土壌細菌や昆虫の腸内細菌の解析とソーティングについて教えてください.

Q99 微細藻類の解析とソーティングについて教えてください.

Q100 植物分野ではどのような解析が行われていますか?

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